DNA测序中的索引转换：对数据完整性的潜在威胁及尖端技术的对抗。揭示这一关键现象的影响、检测及未来发展。(2025)
- 介绍：DNA测序中的索引转换是什么？
- 索引转换的历史背景与发现
- 索引转换的机制：它是如何及为何发生的
- 技术因素：测序平台与协议
- 对基因组数据准确性及研究的影响
- 检测方法：识别与量化索引转换
- 缓解策略：实验室与生物信息学解决方案
- 行业标准与指南（如：Illumina, NIH）
- 市场与公众关注：当前趋势与五年预测
- 未来展望：创新、挑战与前进的道路
- 来源与参考文献
介绍：DNA测序中的索引转换是什么？
索引转换，又称为“索引跳跃”，是在高通量DNA测序平台中观察到的现象，特别是在使用多重测序策略的平台中。在这些方法中，唯一的短DNA序列——称为索引或条形码——被附加到单个DNA样本上。这使得多个样本能够在一次测序中合并并一起测序，期望每个读数可以根据其索引准确地归属于其原始样本。然而，当与DNA片段相关的索引序列错误分配时，就会发生索引转换，从而导致读数被错误归属到错误的样本。
这种错误分配可能发生在测序工作流的各个阶段，包括文库准备、簇生成和测序本身。在使用图案化流动池和排除扩增的测序平台中，特别是在Illumina公司开发的系统中，这个问题尤为突出。在这些系统中，漂浮的适配子或不完全的连接事件可能导致索引序列在DNA片段之间转移，造成部分读数携带错误的索引。
索引转换对许多DNA测序应用的后果是显著的。在稀有变异或低丰度信号重要的研究中——例如单细胞基因组学、宏基因组学或临床诊断——即使是很小的索引错误分配率也可能导致假阳性、污染或错误结论。随着测序通量和多重化水平的提高，索引转换对数据质量和解释的潜在影响变得更加显著。
对索引转换的认识促使基因组学界开发了实验性和计算性策略以缓解其影响。这些策略包括使用独特的双索引（UDI）、改进的文库准备协议和生物信息过滤方法。国家卫生研究院（NIH）和国家人体基因组研究所（NHGRI）等组织强调了在测序研究中准确识别样本的重要性，强调了对索引转换的强健解决方案的需求。
总之，索引转换是现代DNA测序中的一个关键技术挑战，影响着数据完整性、可重复性以及科学和临床发现的可靠性。理解其机制并开发有效的对策仍然是基因组学领域的积极研究与创新方向。
索引转换的历史背景与发现
索引转换现象，即“索引跳跃”，在高通量DNA测序领域在2010年代中期作为一个显著问题浮现。索引转换是指在多重测序运行中样本索引（条形码）的错误分配，导致读数被错误归属到错误的样本。这种伪影可能会损害下游分析的准确性，尤其是在需要高灵敏度的应用中，如单细胞基因组学和宏基因组学。
索引转换的历史背景与下一代测序（NGS）技术的快速发展密切相关。早期NGS平台，如由Illumina和Thermo Fisher Scientific开发的那些，通过将唯一的索引序列附加到每个文库，使得多样本的同时测序成为可能。这种多重化方法显著提高了通量并降低了成本，但也引入了新的错误来源。最初，研究的重点是减少在文库准备和测序过程中发生的交叉污染。然而，随着测序深度和灵敏度的提高，研究人员开始观察到无法用传统污染解释的读数错误分配的意外模式。
2017年，索引转换作为一个独特的技术伪影首次系统地被描述，当时使用Illumina的图案化流动池平台（如HiSeq 4000和NovaSeq）的研究报告了索引错误分配的升高率。研究发现，取代这些新平台中的桥接扩增的排除扩增（ExAmp）化学与增加的索引转换事件相关。这被归因于漂浮的适配子存在以及流动池上簇之间的物理接近性，这使得在簇生成过程中索引序列在文库间转移。这个问题在单细胞RNA测序实验中尤为突出，即使是低水平的索引转换也可能导致显著的数据伪影。
针对这些发现，测序技术提供商，例如Illumina，承认了这一问题，并开始推荐缓解索引转换的最佳实践，包括使用独特双索引和改进文库清理协议。更广泛的基因组学社区，包括国家人体基因组研究所（NHGRI）等组织，随后强调了在实验设计和数据解释中理解和控制索引转换的重要性。到2025年，正在进行的研究继续完善测序化学和信息学方法，进一步减少索引转换对基因组研究的影响。
索引转换的机制：它是如何及为何发生的
索引转换，亦即索引跳跃，是一种在高通量DNA测序中出现的现象，在这些测序中，样本特异性的索引序列（条形码）在文库准备期间错误地与来自其他样本的DNA片段关联。这种错误分配可能导致测序读数的交叉污染，可能会混淆下游分析，尤其是在多个样本一起处理的多重实验中。
索引转换的主要机制与测序平台的化学和工作流程相关，特别是那些使用图案化流动池和排除扩增的，例如某些型号的Illumina。在文库准备期间，唯一的索引序列会连接或纳入到DNA片段中，以便在测序后进行样本识别。然而，在某些情况下，漂浮的适配子或不完整的连接产物可能会留在合并的文库中。在流动池上的簇生成过程中，这些漂浮适配子可以与来自不同样本的DNA片段退火，从而导致在扩增过程中纳入错误的索引。这一过程在使用排除扩增的工作流程中更为严重，DNA片段被固定并在接近的距离内扩增，从而增加了索引错误分配的可能性。
另一个促成因素是使用组合双重索引的策略，其中两个索引（i5和i7）结合使用以增加多重化能力。如果发生索引转换，则一个读数可能会被赋予在原始文库中根本不存在的索引组合，使得追踪该片段的真实来源变得困难。这在需要高灵敏度的应用中尤为成问题，例如单细胞RNA测序，即使是低水平的索引转换也可能引入显著的伪影。
索引转换的概率受到多个因素的影响，包括文库准备的质量、是否存在过量适配子、所使用的测序平台以及流动池的特定化学。例如，图案化流动池旨在提高簇密度和通量，其与非图案化流动池相比，索引转换的发生率更高。此外，使用独特的双重索引（每个样本被赋予一对独特的索引）可以帮助减轻索引转换的影响，使得识别和过滤错误分配的读数变得更容易。
理解索引转换的机制对于研究人员和测序提供商（如Illumina和Thermo Fisher Scientific）至关重要，因为这为改进文库准备协议和测序化学的发展提供了信息。正在进行的研究和技术进步旨在最小化索引转换，从而提高多重DNA测序实验的准确性和可靠性。
技术因素：测序平台与协议
索引转换，亦称为索引跳跃，是DNA测序中的一种现象，其中样本索引（条形码）被错误分配给测序读数，导致多重样本之间序列的错误归属。这个问题在高通量测序平台中尤为重要，这些平台利用组合条形码策略，如由Illumina等下一代测序（NGS）技术全球领导者开发的平台。导致索引转换的技术因素与测序平台的设计和在文库准备及测序运行中所采用的协议密切相关。
测序平台的架构在索引转换的普遍性中起着关键作用。例如，图案化流动池在先进的Illumina测序仪（如NovaSeq系列）中被使用，已被关联到比早期的非图案化流动池设计更高的索引跳跃率。这部分是由于DNA簇的物理接近性和使用排除扩增，这可能使得在测序过程中适配子或索引在簇之间转移。测序反应的化学， 包括使用某些聚合酶和适配子的存在，也可能进一步加剧这一效应。
文库准备协议是另一个重要的技术因素。双重索引策略，其中DNA片段的两端都标记有独特的索引，已被证明比单索引方法减少了索引转换的影响。然而，即使使用双重索引，未完全去除漂浮适配子或不当清理步骤也可能在反应混合物中留下残余索引，增加了错误分配的风险。试剂的选择、酶反应的有效性以及纯化步骤的严格性都会影响索引转换事件的可能性。
测序通量和多重化水平也会影响索引转换的发生率。随着单个测序运行中合并的样本数量增加，索引错误分配的概率上升，特别是当索引不够独特或在样本处理过程中存在交叉污染时。这在大规模基因组项目和临床应用中尤为值得关注，因为准确的样本识别至关重要。
为了解决这些挑战，Illumina等平台制造商和研究联盟制定了最佳实践，包括使用独特的双重索引、严格的文库清理协议以及用于检测和纠正索引转换伪影的计算方法。预计2025年及以后的测序化学、流动池设计和自动化的持续技术创新将进一步减轻索引转换的影响。
对基因组数据准确性及研究的影响
索引转换，亦称为索引跳跃，是一种在高通量DNA测序中出现的现象，其中样本索引（条形码）被错误分配给测序读数。这种错误分配可能对基因组数据的准确性和下游研究的完整性产生重大影响。随着测序平台，特别是那些使用图案化流动池和某些文库准备化学的技术的普及，索引转换的风险和影响已引起基因组学界的更多关注。
索引转换的主要后果之一是引入跨样本的污染。当读数被错误归属到错误的样本时，可能导致假阳性——检测到遗传变异或序列，实际上并不存在于特定样本中。这在涉及低频变异、稀有病原体检测或单细胞测序的研究中尤其成问题，因为即使是少量的错误分配读数也会影响结果并得出错误的生物学结论。例如，在癌症基因组学中，索引转换可能导致体细胞突变的错误识别，可能影响诊断或治疗决策。
索引转换的影响还延及到大规模人口研究和宏基因组学，其中准确的样本去多重化对于可靠数据解读至关重要。在宏基因组调查中，索引转换可能人为地提高微生物群落的多样性或掩盖真实的生物信号，复杂化理解复杂生态系统的努力。同样，在群体遗传学中，读数的错误分配可能使基因结构、谱系和关联研究的分析复杂化，削弱研究发现的有效性。
为了应对这些挑战，测序技术提供商如Illumina已开发改进的文库准备协议和双重索引策略，以减轻索引转换的风险。双重索引，即每个样本使用两个独特条形码，显著降低了错误分配的可能性，因为只有当两个索引同时发生转换时才会出现错误。此外，生物信息学工具和质量控制措施也越来越多地采用，以检测和过滤潜在的索引转换读数，尽管这些方法可能并不能完全消除问题。
索引转换的后果强调了严格实验设计、仔细选择测序平台以及实施稳健的数据分析管道的重要性。随着基因组学领域的不断发展，像国家卫生研究院和国家人体基因组研究院这样的组织的持续努力，旨在建立最佳实践和标准，以确保在面对技术挑战（如索引转换）时基因组研究的准确性和可重复性。
检测方法：识别与量化索引转换
索引转换，亦称为索引跳跃，是一种在多重DNA测序中出现的现象，其中样本索引（条形码）被错误分配给测序读数，导致样本间数据的错误归属。准确检测和量化索引转换对确保数据完整性至关重要，尤其是在宏基因组学、单细胞测序和临床诊断等应用中。已经开发了多种检测方法来识别并量化索引转换事件，利用实验设计和计算分析相结合。
检测索引转换的基础方法涉及使用阴性对照和合成添加物。通过包括具有唯一已知序列或不应与生物样本重叠的合成DNA的样本，研究人员可以监测意外索引组合的出现。在测序数据中检测到这些意外组合提供了索引转换的直接证据。这种方法被测序平台提供商如Illumina广泛推荐，Illumina是一家领先的下一代测序（NGS）仪器制造商，已发布实验设计的指南，以最小化和检测索引跳跃。
另一种常见策略是使用双重索引方案，其中每个样本都被标记为两个独特的索引（i5和i7）。这一方法通过检测在文库准备期间未使用的索引对来识别索引转换。计算工具可以量化这些意外索引对的频率，为索引转换率提供估算。双重索引现在已成为许多测序工作流程的标准做法，正如Illumina和Thermo Fisher Scientific等组织所推荐的，后者是主要的测序试剂和平台供应商。
生物信息学分析在索引转换的检测和量化中发挥着重要作用。算法可以扫描测序数据，查找与任何预期样本分配不匹配的索引组合的读数。通过将观察到的索引对分布与预期分布进行比较，研究人员可以估算索引转换的频率和模式。一些管道还采用统计模型以区分真正的索引转换和测序错误或交叉污染。国家卫生研究院（NIH）作为主要的生物医学研究机构，支持开发开源工具和最佳实践，以分析多重测序数据，强调稳健计算检测方法的重要性。
总之，DNA测序中索引转换的检测和量化依赖于实验对照、双重索引策略和先进的生物信息学分析相结合。遵循领先组织和测序技术提供商推荐的最佳实践，对于最小化索引转换的影响并确保测序结果的可靠性至关重要。
缓解策略：实验室与生物信息学解决方案
索引转换，亦称为索引跳跃，是高通量DNA测序中的一个良好记录的伪影，特别是在多重实验中，其中多个样本被合并并通过唯一的索引序列区分。这一现象可能导致读取的错误分配，损害数据完整性和下游分析。随着测序技术和应用在2025年不断扩展，强有力的缓解策略——无论在实验室还是生物信息学层面——对于确保数据准确性至关重要。
实验室解决方案
- 双重索引：最有效的实验室策略之一是使用独特的双索引（UDI），每个样本被标记为两个不同的索引序列。这种方法显著减少了错误分配的概率，因为要错误归属一个读数，两个索引都需要同时转换。主要的测序平台提供商，如Illumina，已纳入UDI试剂盒和协议来解决这一问题。
- 优化的文库准备：仔细优化文库准备协议可以最小化已知引起索引转换的自由适配子污染。这包括彻底的珠子清理和酶催化下过量适配子的去除。像Thermo Fisher Scientific这样的组织提供指导与试剂以支持这些最佳实践。
- 平台选择与化学更新：一些测序平台和化学试剂比其他平台更容易发生索引转换。例如，图案化流动池和排除扩增技术与更高的索引跳跃率相关。更新制造商的最新平台改善和化学发布有助于实验室选择减少索引转换发生率的系统。
生物信息学解决方案
- 严格的去多重化算法：先进的去多重化工具可以配置为需要与两个索引序列的完全匹配，丢弃具有模糊或意外索引组合的读数。这减少了进入下游分析的错误分配读数的风险。
- 统计过滤与污染检测：生物信息学管道可以整合统计模型，以识别和过滤低频索引组合，这些组合可能是索引转换的结果。一些管道还标记或移除出现在意外索引对中的读数，进一步提高数据质量。
- 跨样本污染评估：定期使用内部对照或合成添加物评估跨样本污染可以帮助量化和纠正索引转换伪影。这在单细胞测序或稀有变异检测等敏感应用中尤为重要。
总之，减轻DNA测序中索引转换所需的是实验室最佳实践与复杂的生物信息学方法的结合。Illumina和Thermo Fisher Scientific等测序技术提供商与科学界之间的持续合作，继续推动实验设计和数据分析的改进，确保在2025年及以后的多重测序数据的可靠性。
行业标准与指南（如：Illumina, NIH）
索引转换，亦称为索引跳跃，是高通量DNA测序中一个公认的技术伪影，尤其是在多重测序工作流程中。这一现象发生在样本索引（条形码）被错误分配给测序读数时，导致样本间数据的错误归属。随着下一代测序（NGS）在研究、临床和工业应用中的采用日益增加，制定健全的行业标准和指南以减轻和监控索引转换的需求变得日益重要。
主要测序平台提供商，如Illumina，在确立最佳实践以最小化索引转换方面发挥了核心作用。Illumina作为全球NGS技术的领导者，已发布技术说明书和协议，解决索引转换的原因，特别是在图案化流动池平台和使用单索引文库时。它们的建议包括使用独特的双重索引（UDI）策略，即每个样本使用两个独立的条形码，显著降低错误归属的风险。Illumina还提供经过验证的索引集和去多重化的软件工具，旨在检测和纠正潜在的索引转换事件。
除了制造商的指南，广泛的科学和监管组织也为标准的制定贡献了力量。国家卫生研究院（NIH）作为美国领先的生物医学研究机构，已向在联邦资助项目中使用NGS的研究人员发布了指导，鼓励采用双重索引和严格的质量控制措施，特别是在可能会影响数据完整性或患者安全的研究中。这些建议通常被纳入资助要求和数据共享政策中。
在国际上，像国际标准化组织（ISO）这样的组织已制定基因组学中实验室实践的标准，包括生物银行的ISO 20387和医学实验室的ISO 15189。尽管这些标准并不总是特定于索引转换，但它们强调可追踪性、方法验证和文档记录——这些原则对于有效检测和减轻索引错误分配至关重要。
此外，专业社团和联盟，如全球基因组和健康联盟（GA4GH），发布了NGS数据质量和样本追踪的最佳实践框架。这些框架通常参考了制造商的协议和监管指导，推动了实验室和法域间的协调。
总之，针对DNA测序中索引转换的行业标准和指南是由制造商的协议、国家研究机构的建议和国际实验室标准共同塑造的。遵循这些指南对于确保数据准确性、可重复性和下游分析的可靠性至关重要，无论是在研究还是临床环境中。
市场与公众关注：当前趋势与五年预测
索引转换，亦称为索引跳跃，是一种在DNA测序中出现的现象，其中样本索引（条形码）被错误分配给测序读数，导致多重样本之间的交叉污染。这个问题在高通量测序平台，特别是由Illumina等基因组技术的全球领导者开发的平台中尤为相关。随着下一代测序（NGS）在临床诊断、研究和生物技术中的采用不断扩大，市场和公众对解决索引转换的关注显著增加。
到2025年，DNA测序市场仍在经历稳健增长，推动力来自对精准医疗、人口基因组学和传染病监测日益增长的需求。全球NGS市场预计将以超过15%的复合年增长率（CAGR）扩展，北美、欧洲和亚太地区是主要活动区域。在这背景下，测序数据的完整性至关重要，索引转换已成为一个关键的质量关注点。主要测序平台提供商，包括Illumina和Thermo Fisher Scientific，通过开发改进的文库准备试剂盒、双重索引策略和软件解决方案来应对索引错误分配的风险。
公众对测序数据可靠性的兴趣也在上升，尤其是当基因组信息成为医疗决策和公共卫生政策的核心。美国食品药品监督管理局等监管机构和像世界卫生组织这样的国际组织越来越关注基因组检测的标准和可重复性，包括技术伪影如索引转换的影响。这已导致最佳实践指南的发布以及临床测序工作流中质量控制指标的整合。
展望未来五年，趋势朝着更大的自动化、更高的通量和更复杂的测序工作流多重化发展。这可能会增加索引转换的潜力，除非通过持续创新加以抵消。预计市场将在强有力的索引化学、误差修正算法和第三方验证服务上进一步投资。此外，随着测序在分散和临床现场环境中的采用，将需要用户友好的解决方案，以最小化索引转换。
总之，对DNA测序中的索引转换的市场和公众关注预计将在2030年前进一步加剧，推动力来自基因组学在医学和研究中的日益重要的角色。利益相关者，包括技术开发者、监管机构和最终用户，预计将优先考虑确保数据保真度的解决方案，支持基于测序的应用的持续增长与信任。
未来展望：创新、挑战与前进的道路
索引转换，亦称为索引跳跃，仍然是高通量DNA测序中的一个重要问题，特别是在多重实验中，其中样本被合并并通过唯一的索引序列区分。随着测序技术的进步和应用的扩展——从临床诊断到大规模人口基因组学——解决索引转换的需求变得愈加紧迫。展望2025，管理和缓解索引转换的未来前景受到技术创新和持续挑战的影响。
创新的最有希望领域之一是改进文库准备化学和测序平台的开发。主要测序技术提供商，如Illumina和Thermo Fisher Scientific，正积极优化其试剂和协议，以最小化索引错误分配的风险。例如，采用独特的双重索引（UDI）策略——每个样本使用两个独立的索引序列——已经显示出显着减少索引转换事件。对寡核苷酸合成和纯化的进一步改进预计将降低导致错误分配的背景噪声。
在计算方面，生物信息学工具正在演变，以更好地检测和纠正索引转换。建模索引组合预期分布并标记异常模式的算法正在整合到标准的测序数据分析管道中。这些进步得到了国家卫生研究院（NIH）等组织的合作支持，该机构资助针对测序伪影的实验和计算解决方案的研究。
尽管有这些进展，仍然存在一些挑战。随着测序通量的提高和样本多重化的普及，即使是低水平的索引转换也可能对数据质量产生显著影响，特别是在需要高灵敏度的应用中，如稀有变异检测或单细胞测序。此外，测序平台和化学的多样性使得制定通用解决方案变得复杂。由国家人体基因组研究所（NHGRI）等机构主导的行业最佳实践的标准化，对于确保数据完整性至关重要。
展望未来，减少索引转换的道路可能涉及改进实验室协议、稳健的计算修正方法和行业范围的标准。技术开发者、研究机构和监管机构之间的持续合作将对于确保高通量测序的益处不被技术伪影所掩盖至关重要。随着该领域朝着日益庞大和复杂的测序项目迈进，解决索引转换仍将是基因组学界的优先事项。
来源与参考文献
https://youtube.com/watch?v=WKAUtJQ69n8